DDPCR檢測
▏ 服務(wù)原理
研究PCR技術(shù)從1983年開始依次經(jīng)歷普通PCR,Real-Time PCR和dPCR,現(xiàn)如今dPCR技術(shù)的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣,發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例,討論dPCR技術(shù)。
什么是DdPCR? 有什么技術(shù)特征?有哪些方面的應(yīng)用?
DdPCR全稱Droplet Digital PCR,引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.
從基本原理我們不難看出,DdPCR最大的優(yōu)點是絕對定量,表現(xiàn)為:
· 絕對定量 -ddPCR技術(shù)無需輸入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可提供每個輸入樣品的目標(biāo)DNA拷貝的絕對計數(shù),使該技術(shù)非常適合目標(biāo)DNA的測量,病毒載量分析和微生物定量;
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數(shù)的微小差異;
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景,有效富集靶標(biāo)陽性分區(qū)中的模板濃度,從而可以靈敏地檢測稀有靶標(biāo),并實現(xiàn)±10%的定量精度,靈敏度可達單個核酸分子,檢測限低至0.001%;
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴性,降低了錯誤率,可檢測到小的(1.2倍)差異,這里需要指出的是;
· 降低了耗材成本 -反應(yīng)體積在皮升至納升的范圍內(nèi),減少了試劑的使用和每個數(shù)據(jù)點所需的樣品量,對于珍貴的樣品尤其適用;
· 降低設(shè)備成本 -基于乳液的反應(yīng)系統(tǒng)意味著PCR反應(yīng)可以在標(biāo)準(zhǔn)的熱循環(huán)儀中進行,而無需復(fù)雜的芯片或微流體。
· 出色的分區(qū) -ddPCR技術(shù)每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個液滴,在96孔板上可進行近200萬個分區(qū)PCR反應(yīng),分區(qū)數(shù)量越多,精度越高。
▏ 服務(wù)應(yīng)用
DdPCR技術(shù)有很多方面的應(yīng)用,我們按照發(fā)表文章的領(lǐng)域,可以簡單劃分為:
結(jié)合腫瘤領(lǐng)域,我們一般與之相關(guān)的有4個領(lǐng)域的應(yīng)用:
1. 檢測Gene Expression,主要是檢測mRNA的定量分析;
2. 檢測Mutation(SNV和Indel),可以檢測拷貝數(shù),也可以檢測比率;
3. 檢測CNV(拷貝數(shù)變異分析),相對定量;
4. 檢測Fusion,可以檢測拷貝數(shù),也可以檢測比率;
▏ 案例展示
同樣的,科佰生物也針對這4個應(yīng)用開發(fā)對應(yīng)的檢測試劑盒,配套科佰生物的參考品,對試劑盒做性能評價,如下我們以EGFR T790M為例:
實驗一:靈敏度測試
待測樣本:不同%AF的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品,依次為5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%。
首先我們選擇50%的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402),該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗證,確認為50%的頻率。然后使用對應(yīng)的host cell的gDNA,按照質(zhì)量比(Qubit 3.0 三次定量取平均)有限稀釋到5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,每個樣本準(zhǔn)備3個重復(fù),合計18個樣本同一次實驗檢測對應(yīng)的頻率。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為:
由以上數(shù)據(jù)可見,EGFR T790M檢測體系,對于0.1%都是能檢出,且符合標(biāo)準(zhǔn),但是波動比較大。另外實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)雖然DdPCR理論上可以生成20000個液滴,但是多次實驗表明,實際生成往往是低于這個數(shù)值,平均約為8000-10000個,液滴數(shù)越少,因此低于0.1%的頻率可能會波動很大,影響真實值判斷。
實驗二:重復(fù)性測試
待測樣本:取1%和0.1%的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品,分成8份,每份上樣10ng,一次實驗完成對應(yīng)的定標(biāo)。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為:
由以上數(shù)據(jù)可見,EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的,全部能檢出。
同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開發(fā)了部分DdPCR試劑盒,利用科佰特有的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品,我們做了性能評價,陸續(xù)上線了多款產(chǎn)品,如下是我們已經(jīng)上線的DdPCR探針、引物的清單,全部在QX200上驗證過:
更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開發(fā)定制,我們不僅可以開發(fā)定制探針、引物,我們還有標(biāo)準(zhǔn)品用于驗證體系性能評價。
實驗一:靈敏度測試
待測樣本:不同%AF的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品,依次為5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%。
首先我們選擇50%的EGFR T790M標(biāo)準(zhǔn)品(CBP10402),該標(biāo)準(zhǔn)品是通過基因編輯,二等位基因,CN=2,編輯一條為mutation,一條為WT,經(jīng)過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒(Assay ID: dHsaCP2000019)共同驗證,確認為50%的頻率。然后使用對應(yīng)的host cell的gDNA,按照質(zhì)量比(Qubit 3.0 三次定量取平均)有限稀釋到5%,2%,1%,0.5%,0.2%,0.1%,每個樣本準(zhǔn)備3個重復(fù),合計18個樣本同一次實驗檢測對應(yīng)的頻率。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為:
由以上數(shù)據(jù)可見,EGFR T790M檢測體系,對于0.1%都是能檢出,且符合標(biāo)準(zhǔn),但是波動比較大。另外實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)雖然DdPCR理論上可以生成20000個液滴,但是多次實驗表明,實際生成往往是低于這個數(shù)值,平均約為8000-10000個,液滴數(shù)越少,因此低于0.1%的頻率可能會波動很大,影響真實值判斷。
實驗二:重復(fù)性測試
待測樣本:取1%和0.1%的EGFR T790M的標(biāo)準(zhǔn)品,分成8份,每份上樣10ng,一次實驗完成對應(yīng)的定標(biāo)。
對應(yīng)的數(shù)據(jù)為:
由以上數(shù)據(jù)可見,EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復(fù)的,全部能檢出。
同樣的我們也對Gene Expression(mRNA)、CNV和Fusion開發(fā)了部分DdPCR試劑盒,利用科佰特有的標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)品,我們做了性能評價,陸續(xù)上線了多款產(chǎn)品,如下是我們已經(jīng)上線的DdPCR探針、引物的清單,全部在QX200上驗證過:
更多的DdPCR產(chǎn)品可以選擇科佰生物開發(fā)定制,我們不僅可以開發(fā)定制探針、引物,我們還有標(biāo)準(zhǔn)品用于驗證體系性能評價。